华中科技大学袁菁骆清铭团队首创数字阵列调制显微成像技术实现三维超分辨成像

　　华中科技大学袁菁教授、海南大学骆清铭院士团队发明了一种数字阵列调制显微镜(DaMo)，实现横向分辨率100 nm，轴向分辨率300 nm的无伪影、高质量、高通量三维超分辨成像。该方法照明调制对比度拉至100%，图像保真度达到99±1%，重建速度提升了100倍，信背比提升了3个数量级。3月26日，研究成果以 “Threedimensional superresolution imaging with suppressed background via digital array modulation microscopy”为题发表在Nature Photonics上。

　　武汉光电国家研究中心李思洁博士生与金锐博士为并列第一作者，袁菁教授与骆清铭院士为并列通讯作者。鲁梦琦硕士生、张朦博士、魏云飞博士、张湛博士生、郭诗睿博士生、张玉慧教授、龚辉教授以及陆军军医大学张宁博士、王锋超教授为共同作者。

　　光学显微镜自诞生以来，一直是生命科学研究的重要工具。然而，衍射极限长久以来如同“紧箍咒”，束缚着科学家对纳米尺度世界的探索。超分辨成像技术的出现打破了这一桎梏，其中超分辨结构光照明显微镜(SR-SIM)凭借其优异的标记兼容性，成为解析细胞器变化机制的利器。SR-SIM的核心思路是利用结构化照明对荧光信号进行调制，借助莫尔效应将样品中原本不可见的高频细节信息搬移到显微镜能够探测到的范围内，再通过Wiener重建算法还原出一张分辨率比传统显微镜提升一倍的超分辨图像。

　　然而，自2000年问世以来，SR-SIM在重建图像时易产生伪影、保真度不高的问题便如影随形，成为该技术领域久攻不下的核心痛点。造成这一问题的根本原因在于，传统方法采用的宽场成像光路在面对存在强烈背景干扰的非理想生物样本时，很难有效抵抗噪声和离焦背景的干扰。离焦背景与噪声的存在，在频域重建过程中易被放大，引入严重的重建伪影，损害图像真实度与分辨率。现有方案多依赖于复杂的数据后处理来弥补这一缺陷，但这种“先污染后治理”的思路无法从根本上消除重建伪影来源，反而使计算流程变得复杂冗长，且后处理带来的改善往往有限，甚至可能引入不真实的图像特征，严重限制了其在复杂生物样本中的广泛应用。

　　研究团队在前期工作中建立了一种全新的离轴成像框架。不同于传统落射式照明成像中照明轴与探测轴共轴的方式，离轴成像框架采用照明与探测轴分离的成像策略。在该框架下，聚焦光斑形成天然的照明调制，阵列探测器捕获其完整的空间分布，在像素层面建立起一一对应的关系。由此，每个探测器像素都与一个特定的照明子区域形成共轭，以固有的离轴方式记录其独特调制的信号。在扫描成像过程中，样本点依次通过各照明子区域，使得单次扫描即可获取时间复用且空间编码的原始数据集，直接支撑了新型成像方法的灵活开发。DaMo正是这一框架下的集大成之作。

　　DaMo彻底跳出了传统SR-SIM的固有范式，通过对天然高斯照明叠加虚拟阵列调制，将正弦调制的对比度提升至100%，并基于厄米特对称性提出了单频谱重建算法，将重建速度提升两个数量级，信背比提升3个数量级，实现了横向100纳米、轴向300纳米的三维分辨率。

　　核心创新亮点：第一，调制对比度提升至100%，从源头消除了重建伪影。传统SR-SIM采用零差探测成像，直接记录正弦调制的荧光图像，调制对比度的理论上限仅为50%，在实际应用中还极易受噪声和背景干扰而进一步下降。DaMo利用线照明的天然高斯分布，结合阵列探测器的数字调制，实现了无需物理器件的100%高频对比度外差探测成像。该设计将能量最大化分配至高频分量，同时借助线照明的共聚焦效应，从物理底层有效抑制了离焦背景，彻底解决了传统方法因噪声和背景干扰而产生的重建伪影问题。第二，重建算法极致简化，保真度达99%，计算速度提升两个数量级。传统SR-SIM采用全频谱重建，计算过程复杂且耗时。DaMo独创的单频谱重建算法，首次利用厄米特对称性将原本复杂的重建过程简化为线性计算，同时仅使用高级次频谱参与重建，进一步增强了对背景干扰的抑制效果。该算法不仅使重建速度提升两个数量级，能够在成像的同时完成图像重建，更实现了99±1%的图像保真度，确保了成像结果的真实可靠。得益于上述技术创新，DaMo仅凭横向调制便同时打破了横向和轴向的衍射极限，无需任何计算增强处理，即为复杂生物体系的观测提供了真正无伪影、高质量、高通量的三维超分辨成像手段。

　　DaMo的颠覆性不止于技术参数，更在于其强大的生物学应用潜力。研究团队通过一系列实验，充分展示了这一新方法的独特价值。

　　活细胞中肌动蛋白的超分辨成像一直颇具挑战，传统方法难以将微弱的肌动蛋白信号与噪声分离。得益于其超高的图像质量，DaMo成功实现了对U2OS活细胞中肌动蛋白的时序记录，首次观察到丝状伪足延伸并级联融合的动态过程。这些结果充分展现了DaMo解析关键细胞过程中肌动蛋白时空动态的能力。此外，DaMo还具有较低的光毒性，在连续拍摄千余帧后细胞仍能保持活性。

　　传统细胞器动态研究多依赖单细胞长时程观察，需在形态细节与群体统计效力之间权衡，存在采样广度、时间稳定性及实验成本等方面的局限。为此，该研究提出了一种全新的高内涵分析途径，通过对非同步化细胞进行全涂片快照式成像，无差别地获取各阶段具有统计学意义的形态学特征，从而实现高效的周期分析。DaMo用20分钟完成了全涂片万余个U2OS细胞的三色超分辨成像与同步重建，清晰揭示了从纺锤体形成、染色体分离到新细胞形成的完整有丝分裂过程。

　　组织切片的背景噪声更强，整体空间异质性更复杂，对传统超分辨成像技术构成了较大挑战。而DaMo凭借其高质量、高通量的特性，有效突破了这一瓶颈。该工作展示了DaMo对10毫米见方小鼠小肠完整冰冻切片的三通道超分辨成像结果，实现了1.92 TB原始数据的高效采集与在线重建。在此基础上，该工作还对小鼠小肠炎症模型下不同肠段、不同部位的线粒体病变进行了定量统计与分析，充分展现了DaMo在组织水平实现跨尺度、高保真超分辨成像的独特优势。

　　DaMo的问世，为超分辨成像领域提供了一种兼顾分辨率、通量、信背比与普适性的三维成像新范式。它以软硬件协同优化为核心，实现了无需复杂调制器件、无需图像后处理增强的纯净成像路径，打通了从亚细胞器到组织架构的跨尺度观测链路。无论是活细胞、全细胞涂片，还是完整组织切片，该方法都展现出了出色的成像能力。这为生物医学基础研究与临床诊断带来了全新的可能，也让高内涵超分辨成像分析有望在更多科学议题中大显身手。